一、主要用途：
YT微孔板使用固定在微孔板上的94个不同的生化试验来对广泛的酵母菌提供表型概况并 进行鉴定。Biolog鉴定系统中的软件（MicrologTM 3）通过读取YT微孔板上所表现出的表型图谱 来对细菌进行鉴定。
二、概述：
1、Biolog YT微孔板通过微生物对微孔板中的不同碳源的利用及氧化情况进行测试，测试 使得有特征代谢的孔变成紫色，从而使微生物在测
试板上显示出“代谢指纹图谱 ”1，2。
2、所有必要的营养物质以及生化试剂都被预先填充、干化在96个孔中。在一部分孔中 （A-C行），四唑类氧化还原染料通过色度的变来指
示碳源的氧化情况。而剩下的孔（D-H行）则通过浊度的变化来显示微生物对碳源的利用情况。
3、试验的操作过程非常简单。在平板上按照常规方法划线分离需要鉴定的微生物，然后 将分离的到的纯种用棉签挑到无菌水中，配成指定细胞浓度的菌悬液。将菌悬液按每 孔100μl的量加到YT板后孵育。所有的孔在刚开始的时候都是无色的，当孵育一段时 间之后，那些能被细胞利用的碳源孔中的呼吸作用增强了。增强的呼吸作用导致四唑 氧化还原染料被还原，变成紫色。同时，能被利用的碳源孔中的微生物也开始生长， 导致浊度变高。YT板的两个阴性对照孔（A1和D1）中不含碳源。
4、孵育后24，48或者72小时后，通过YT板上显紫色及浊度变化所产生的指纹图谱同 Biolog数据库中的数据进行比对。如果找到匹配的，所分离出来的微生物得到鉴定。
三、注意事项：
为获取准确且可重复的结果，请务必遵循下列建议：
1、纯培养是一切鉴定的前提，
2、使用专用培养基进行活化培养非常重要，同一菌株可能会由于接种前在不同的培养基上生 长而在鉴定时产生不同的代谢特征。
3、无菌操作，避免污染影响结果。
4、应尽量使用一次性玻璃器皿来处理所有细胞悬液和其他溶液。已经清洗过的玻璃器皿可能 含有微量的皂剂或洗涤剂，会影响到结果。
5、在使用前将YT微孔板及无菌水接种液预热到室温。一些菌种对冷冲击非常敏感。
6、准确校正浊度仪，使菌悬液浓度位于指定的浓度范围。请参考“接种液制备”这一部分内 容。
7、YT鉴定板上包被的化学物质对温度和光敏感。AN微孔板请置于2-8℃冰箱，避光保存。如 孔颜色为深褐色表示鉴定板碳源已变质。一些孔本身就是黄色或浅红色，这是正常的。
8、请永远记住：你正在测试的是活细胞的代谢特性。一些菌种在受到应激作用（如温度、pH 及渗透压变化）时会失去代谢活力，哪怕是仅仅几分钟。为了从这些微孔板上获得可接受 的最佳效果，请意识到这些细胞是活的，并小心的对待它们。
9、检查 YT 鉴定板：
请勿使用过期的 YT 鉴定板。要将其带着外包装放于 2-8℃冰箱，避光保存。
四、试剂及耗材：
1、YT MicroPlates YT微孔板: Catalog No.1005 - Biolog YN MicroPlates (10/box).
2、BUY Agar BUA培养基: BUY (Biolog Universal Yeast) Agar (Biolog Catalog #70005).
3、Sterile water 无菌水接种液: Sterile disposable glass (borosilicate) test tubes, 20ml
capacity (20 x 150mm)，containing 12 to 15 ml of sterile water, pH 5.5-7.0. 自己制备无 菌水，在无菌间将其转入Biolog提供的相同的规格的玻璃管中（20ml容量，20×150mm）， 每管放入12-15ml无菌水，pH 5.5-7.0.
4、LongSwabsTM 无菌一次性接种棉签: Sterile 7-inch disposable cotton-tipped swabs (Biolog Catalog #3021-3023).
5、StreakerzTM木质无菌一次性接种棒: Catalog No.3025- Sterile disposable wooden agar
plate streakers (10x100); Catalog No.3026 (50x20).
6、Transfer Pipets无菌一次性移液管: Catalog No.3019- Sterile disposable 9 inch transfer pipets.
7、Reservoirs无菌一次性V型加样槽: Catalog No.3102- Sterile disposable reservoirs.
8、Multichannel Pipettes多道移液器: Catalog No.3711- 8 channel electronic pipettor.
9、Pipet Tips无菌移液器吸头: Catalog No. 3201- Sterile racked pipet tips for Ovation multichannel pipettor; Catalog No. 3001- Matrix multichannel pipettor tips.
10、Turbidimeter浊度计: Catalog No.3531- 110 volt model, Catalog No.3532 -220 volt model, Catalog No.3585 - 240 volt model.
11、Turbidity Standards标准比浊管: YT (Biolog Catalog #3415).
12、Incubator 培养箱：26℃ .
五、操作规程：
做实验前，先将YT鉴定板和接种液恢复至室温25度。
第一步：在Biolog推荐的培养基上培养微生物
1、使用其他培养基分离的到纯的培养物。
2、将纯化的培养物转到BUY平板上， 26℃培养。能用YT板鉴定的酵母菌在这个条件下都可 以生长。
3、在BUY上培养两代，然后用第二代的平皿准备菌悬液。
第二步：样品准备
1、使用专用培养基对分离的菌种进行活化培养，选择培养基非常重要，使用专用的BUY培养 基能使待测菌株的代谢特征图谱与数据库中的图谱精确的匹配。
2、菌一定要新鲜培养，因稳定期的细胞会失去活力和代谢活性。对大多数酵母菌推荐的培养 时间为24-48h。
3、如果一些菌生长不足，所生长的菌不足以制成特定浓度接种液以接种至鉴定板，则需要接 种时多接菌到一个或多个平板上以得到足够多的菌，培养24-48h。
第三步：接种准备
1、在浊度仪上调节特定范围的浊度。首先用空白无菌水接种液调至100%，然后利用YT标准 比浊管显示标准浊度，应是47%T，在不同的浊度仪上读数可能有些许变化。
2、使用未接种的含有接种液的干净接种管（擦去管壁污垢及指纹）将浊度仪透光度指针调至100%。由于每只管子在光学性能上并不完全相
同，所以应该分别针对每只接种液来调空白。
3、接种时不要将培养基挑进接种液，先用棉棒蘸些接种液，蘸取菌后在接种液液体上面管壁 上反复涂使其分散，然后利用接种液将其冲洗下
制备成均一接种液。也可利用无菌吸管混 匀菌液，但应避免产生气泡。如果还有未打散的菌块，将接种液静置几分钟，使之沉淀下 去。
4、准确调整菌悬液的菌体浓度到47%T，上下偏差2%。如浓度太高可以加入一些新的接种液， 如浓度太低则继续加入更多菌。
5、制备好菌悬液后，菌悬液倒入v型槽，然后迅速接到板上。接菌悬液的过程不超过20min（超 过20min，一些菌会因失去氮源丧失代谢活力）。
第四步：接种至鉴定板
1、迅速将配制好的菌悬液倒入V型槽中（不要将沉淀倒入），并用移液器将菌悬液接种至YT 板上（每孔100 μl）。
2、接种完后，盖上微孔板盖子。
第五步：培养鉴定板
1、将鉴定板置于26℃培养箱中培养。
2、注意保持培养环境的湿度，以减少微孔板中菌液的蒸发。可以使用在可密封的塑料盒中放
置湿纸巾或砂布，再将微孔板放置其中的方法来保湿。
3、培养鉴定板24，48或者72h，直到微孔板图谱形成。
六、结果
1、培养完毕后请使用MicrologTM 3软件进行结果获取，请参见软件说明书。
2、A1孔作为A-C行的参照孔，D1孔作为D-H行的参照孔。以590nm波长分别测试A-C行的颜 色变化，以及D-H行的浊度变化。一般酵母菌鉴定板的图谱很难用肉眼来判读。
3、“假阳性”是指A1，D1 还有其他本该阴性的孔显示阳性反应。（A1孔显紫色，D1孔产生 浊度变化）。可能的原因包括细胞利用了自身的胞外多糖，储存的内源底物，或细胞裂解的 物质。不正确使用鉴定板也可能产生假阳性，请参考“问题解答”部分。一些酵母菌利用 碳源生成带有颜色的（如褐色）的副产物。这种情况应看作“阳性”反应。
4、对于YT鉴定板，培养24小时后，只有当相似度指数（Similarity Index）大于0.75 ，鉴定结 果才能被接受；而48或72小时培养后，值大于0.5时，鉴定结果才能被接受。
七、问题解答：
如1-9列全是阳性，请确认：
1、确保该菌株适于用YT鉴定板来鉴定。
2、制作菌悬液时，确保不要将平板培养基（含氮源）也挑进接种液中。
3、菌悬液浓度不要过量，检查并校正浊度仪。
4、确保菌悬液的均一，不含菌块。
5、A1，D1孔作为对照孔，加液时不要少加，应与其它孔一致。
如1-9列全是阴性，请确认：
1、确保该菌株适于用 YT 鉴定板来鉴定。
2、需要新鲜培养的酵母菌，使用推荐的培养基BUY。
3、接种液和鉴定板使用前恢复到室温，正确制备菌悬液，有合适的pH值和盐度，不含防腐剂。
4、尽量用一次性的器皿处理细胞（洗刷过的器皿残留的皂剂对细胞有毒害）。
5、接种液浓度要达到特定的浊度，检查并校正浊度仪。
6、用正确的培养温度进行培养。
7、A1，D1孔作为对照，不要将菌悬液加的过多，与其它孔保持一致。
八、局限性：
YT数据库的构建是通过对微生物做大量代谢特征验证后得到的。YT板通常只能鉴定包含在 当前数据库中的菌株。非典型菌株通常只会报告“No Identification”。而培养72小时后SIM低 于0.5的都将报告为“No Identification ”。
九、质控菌种：
(Biolog Catalog No.8045).
1 Candida albicans 白色念珠菌（白色假丝酵母） ATCC 10231
2 Candida geochares ATCC 36852
3 Kluyveromyces marxianus 马克斯克鲁维酵母（酵母型）【Candida kefyr 乳酒假丝酵母（菌 丝体型）】 ATCC 2512
4 Galactomyces geotrichum (Geotrichum candidum) ATCC 34614白地霉（菌丝体型）
当用冻干菌株时，至少要传两代，使其恢复活性， 并调节其相应的生理状态。
鉴定板培养48h，上读数仪读板。如果鉴定结果不符合，重新看一下操作流程，检查菌株是否纯。
YT MicroPlateTM 测试布局
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A1
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A2
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A3
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A4
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A5
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A6
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A7
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A8
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A9
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A10
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A11
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A12
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Water 水
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Acetic Acid 乙酸
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Formic Acid 甲酸
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Propionic Acid 丙酸
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Succinic Acid 琥珀酸
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SuccinicAcid
Mono-Methly 琥珀 酸甲酯
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L-Aspartic Acid L-天冬氨酸
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L-Glutamic Acid L-谷氨酸
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D-Proline D-脯氨酸
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D-Gluconic Acid D-葡萄糖酸
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Dextrin 糊精
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Inulin 菊粉
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B1
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B2
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B3
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B4
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B5
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B6
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B7
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B8
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B9
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B10
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B11
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B12
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D-Cellobiose D-纤维二糖
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Gentiobiose 龙胆二糖
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Maltose 麦芽糖
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Maltotriose 麦芽三糖
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D-Melezitose D-松三糖
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D-Melibiose D-蜜二糖
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Palatinose
6-O-D-吡喃葡萄糖 酰-D-呋喃果糖
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D-Raffinose D-棉子糖
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Stachyose 水苏糖
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Sucrose 蔗糖
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D-Trehalose D-海藻糖
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Turanose 松二糖
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C1
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C2
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C3
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C4
|
C5
|
C6
|
C7
|
C8
|
C9
|
C10
|
C11
|
C12
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N-Acetyl-D-Glucos
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a-D-Glucose
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D-Galactose
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D-Psicose
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L-Sorbose
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Salicin
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D-Mannitol
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D-Sorbitol
|
D-Arobitol
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Xylitol
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Glycerol
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TWEEN 80
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amine
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a-D-葡萄糖
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D-半乳糖
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D-阿洛酮糖
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L-山梨糖
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水杨苷
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D-苷露醇
|
D-山梨醇
|
D-阿拉伯醇
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木糖醇
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丙三醇
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吐温 80
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N-乙酰基 D-葡萄 糖胺
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D1
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D2
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D3
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D4
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D5
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D6
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D7
|
D8
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D9
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D10
|
D11
|
D12
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 Water 水
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 Fumaric Acid 反丁烯二酸
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 L-Malic Acid L-苹果酸
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 Succinic Acid Mono-Methyl Ester 琥珀酸单甲酯
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 Bromosuccinic Acid
磺琥珀酸
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 L-Glutamic Acid L 谷氨酸
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 y-Aminobutyric Acid
y-氨基丁酸
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 a-Ketoglutaric Acid a-酮戊二酸
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 2-Keto-D-Gluconic Acid
2-酮葡萄酸
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 D-Gluconic Acid D-葡萄酸
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 Dextrin 糊精
|
 Inulin 菊粉
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E1
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E2
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E3
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 E4
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E5
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E6
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E7
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E8
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E9
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E10
|
E11
|
E12
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D-Cellobiose
|
Gentiobiose
|
Maltose
|
Maltotriose
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D-Melezitose
|
D-Melibiose
|
Palatinose
|
D-Raffinose
|
Stachyose
|
Sucrose
|
D-Trehalose
|
Turanose
|
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D-纤维二糖
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 龙胆二糖
|
 麦芽糖
|
 麦芽三糖
|
D-松三糖
|
 D-蜜二糖
|
|
 D-棉子糖
|
 水苏四糖
|
蔗糖
|
海藻糖
|
 松二糖
|
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F1
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F2
|
F3
|
F4
|
F5
|
F6
|
F7
|
F8
|
F9
|
F10
|
F11
|
F12
|
|
N-Acetyl-D-Glucos
|
D-Glucosamine
|
a-D-Glucose
|
D-Galactose
|
D-Psicose
|
L-Rhamnose
|
L-Sorbose
|
a-Methyl-D-Glucos
|
?-Methyl-D-Glucos
|
Amygdalin
|
Arbutin
|
Salicin
|
|
amine
|
D-氨葡萄胺
|
a-D-葡萄糖
|
D-半乳糖
|
D-阿洛酮糖
|
L-鼠李糖
|
L-山梨糖
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ide
|
ide
|
杏甘
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熊果苷
|
水杨苷
|
|
 N-乙酰基 D-葡萄 糖胺
|
|
|
|
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 b-甲基 D-葡糖苷
|
 ?-甲基-D-葡糖苷
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G1
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G2
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G3
|
G4
|
G5
|
G6
|
G7
|
G8
|
G9
|
G10
|
G11
|
G12
|
|
Maltitol
|
D-Mannitol
|
Sorbitol
|
Adonitol
|
D-Arabitol
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Xylitol
|
I-Erythritol
|
Glycerol
|
Tween 80
|
L-Arabinose
|
D-Arabinose
|
D-Ribose
|
|
麦芽糖醇
|
 D-苷露醇
|
 山梨醇
|
 核糖醇
|
 D-阿拉伯醇
|
 木糖醇
|
 I-赤藻糖醇
|
丙三醇
|
吐温 80
|
 L-树胶醛醣
|
 D-树胶醛醣
|
 D-核糖
|
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H1
|
H2
|
H3
|
H4
|
H5
|
H6
|
H7
|
H8
|
H9
|
H10
|
H11
|
H12
|
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 D-Xylose D-木糖
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 Succinc Methyl
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Acid Ester
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 N-Acetyl-L-Glutam ic Acid plus D-Xylose N- 乙酰 基-L-谷氨酸+D-木 糖+-D-木糖
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 Quinic Acid plus D-Xylose
奎尼酸+D-木糖
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 D-Glucuronic Acid plus D-Xylose
D-葡萄醛酸+-D-木 糖
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 Dextrin plus
D-Xylose
糊精+-D-木糖
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 a-D-Lactose plus
D-Xylose
a-D-乳糖+木糖
|
 D-Melibiose plus
D-Xylose
D-蜜二糖+D-木糖
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 D-Galactose plus
D-Xylose
D-半乳糖+D-木糖
|
 m-Inositol plus
D-Xylose
m-纤维醇+D-木糖
|
 1,2-Propanediol plus D-Xylose
1,2- 丙二醇+D- 木 糖
|
 Acetoin plus
D-Xylose
3-羟基丁酮+D-木 糖
|
|
plus-D-Xylose
琥珀酸甲酯+D-木 糖
|
